shRNA慢病毒表达载体构建

1. 简介

siRNA直接转染细胞可以方便的实现瞬时基因沉默，通常持续时间在3－7天左右，因目标基因差异而定，但是转染效率极低。对于一些半衰期长的蛋白，要想观察蛋白表达下降对细胞表型的长期影响就需要长期研究目标基因沉默的效果，shRNA表达载体是更适合的选择。

shRNA是short hairpin RNA 的缩写，翻译为短发夹RNA。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后在连上5－6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。携带目标基因shRNA的表达载体转染或转导到目标细胞中，载体表达shRNA并被Dicer酶切割为siRNA，从而引发目标基因的沉默。shRNA表达载体可分为质粒载体和病毒载体，病毒载体又分为慢病毒载体和腺病毒载体。

慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、干细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

2. shRNA慢病毒表达系统特点

（1）可以大大提高对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞和处于非分裂状态细胞等转导效率；

（2）目的基因整合到宿主细胞基因组的机率大大增加；

（3）能够插入较大的片段（＞3 kb）；

（4）细胞毒性较低；

（5）能够用于干细胞研究；

（6）能够快速获得高水平的表达。

3. 慢病毒表达系统组成

（1）慢病毒表达载体；

（2）慢病毒包装质粒；

（3）可产生假病毒颗粒的细胞系

4. shRNA慢病毒载体构建方法

（1）根据目的基因相关信息，利用高效的设计软件，设计shRNA序列，针对每条目的基因，推荐设计4条shRNA序列，其中一条为阴性对照；

（2）在设计的siRNA序列中间加入loop序列，两段经过适当修饰，加上酶切位点的目的基因序列，根据设计好的shRNA，合成两条互补的短片段DNA；

（3）对合成好的DNA片段进行适当稀释、退火，与线性化的载体（穿梭载体）连接、转化、涂平板、过夜培养；

（4）利用PCR方法进行鉴定，筛选阳性菌落并测序，用测序正确的菌株用于后续研究；

（5）对于测序正确的菌落，提取和纯化高质量的不含内毒素的shRNA慢病毒穿梭质粒；

（6）取穿梭质粒和慢病毒表达载体进行重组反应，然后进行转化，利用PCR方法进行鉴定，筛选阳性菌落并测序；

（7）将阳性重组载体与病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

（8）浓缩、纯化病毒液，进行滴度测定，要求病毒滴度＞10⁸TU/mL；

（9）浓缩和纯化好的shRNA慢病毒表达载体转导目标细胞，目的基因进入到宿主细胞后，经过反转录整合到宿主基因组上，从而高水平表达效应分子。

注意事项： 要求指明基因名称、种属、GI号、载体。

慢病毒包装 腺病毒包装

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