js99990金沙(澳门)有限公司Welcome

实时荧光定量PCR(Taqman探针法)

2017-05-11

comprar naltrexona online

comprar naltrexona espa?a

buy prednisolone

buy prednisolone

buy clomid tablets

buy clomid tablets

buy viagra uk

buy viagra online uk

tamoxifen

tamoxifen

accutane without insurance reddit

buy accutane europe

amoxil suspension

amoxil suspension aaronnush.com buy amoxicillin for chickens

clomid uk success rates

clomid uk prescription liquidity.com clomid uk buy online

clomid online reviews

clomid online

buy prednisolone 25mg tablets

buy prednisolone eye drops over the counter blog.globalmamas.org prednisolone london

accutane without gelatin

buy accutane pills

prednisolone weight gain

buy prednisolone 5mg uk azpodcast.azurewebsites.net prednisolone pharmacy

amoxicillin without insurance

amoxicillin without insurance

order abortion pill online

usa buy abortion pill

buy albuterol inhaler from mexico

albuterol inhaler instructions go albuterol inhaler how to use

misoprostol philippines

pregnancy termination in manila

usa buy abortion pill

buy abortion pill uk

antibiotic without insurance

buy amoxicillin online

buy accutane 10mg uk

buy accutane cream click here accutane without blood tests

Amitriptyline for Anxiety

buy amitriptyline

usa buy abortion pill

abortion pill kit jlopresti.fr medical abortion

order abortion pill online usa

medical abortion blog.halan.se abortion pill kit

                                             实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)


1. 原理

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠,且2个基团距离足够近时,能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团,相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽,这个过程称为FRET。

实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团,使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系,从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型,符合2N方程(其中N为PCR的循环次数),但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别,之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量,并由此推断起始模板含量。

2. 类型

    实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。

3. TaqMan探针

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

常规TaqMan探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素),3’端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该探针在PCR过程中不能被延伸。根据FRET原理,当探针保持完整时,3’端淬灭基团抑制5’端发射基团的荧光发射。在PCR的退火期,探针与模板发生特异性杂交,延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸,当到达探针处,Taq酶发挥5’-3’外切活性,继而发生置换。切断探针后,FAM与TAMRA分离,荧光信号得到释放。这时荧光探测系统就能检测到光密度有所增加。模板每复制1次,就有1个探针被切断,并有1个荧光信号被释放。

由于理论上被释放的荧光基团数和PCR产物数是一对一的关系,且光密度同被释放的荧光基团数也呈正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量。但TaqMan也存在一定不足,主要表现在:①由于采用荧光和淬灭基团双末端标记,因此淬灭难以彻底,本底较高。②报告基团的水解利用的是Taq酶的5’-3’外切活性,因此定量时容易受酶活性影响。③探针标记成本较高,不便普及应用。

另外还有TaqMan MGB(minor groove binder)探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等特异性检测技术。

4. 实验步骤

(1)样品RNA的提取

    取新鲜的组织或细胞(如果不能立即开展实验,应将样品置于-80℃冰箱保存),加入适量的Trizol裂解液,使组织或细胞中的内容物释放出来。采用有机溶剂氯仿/异丙醇抽提,提取组织或细胞中的总RNA。

(2)RNA浓度及纯度检测

    采用琼脂糖凝胶电泳定性检测提取的总RNA的浓度及纯度,并且使用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。

(3)cDNA第一条链的合成

按照说明书的要求在反应体系中加入0.5~1 ug的总RNA、RT prime、dNTP Mix、RNase Inhibitor 、RT Enzyme、RT Buffer,用ddH2O补足体积。保证每个样品加入的总RNA量相同。然后置于PCR仪中扩增合成cDNA第一条链。

(4)待测样品的管家基因及待测基因实时荧光定量PCR

实验开始时根据实验要求设计并合成内参基因、待测基因引物和特异性的荧光探针。按照说明书要求在反应体系中加入SYBR Green Mix、cDNA模版、内参基因或待测基因上下游引物,特异荧光探针,用ddH2O补足体积。然后置于荧光定量PCR仪中,设置好参数,进行扩增。

(5)数据处理

观察扩增曲线和溶解曲线,根据实验结果数据,计算样品Ct值。

5. PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:

(1)将PCR反应的试管与反应板紧贴;

(2)当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热; 

(3)不要随意减少dNTP的用量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡;

(4)对于有问题的PCR反应,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加Taq酶前的体系进行预变性,后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物:

(1)在提供MgCl2缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;

(2)泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgCl2,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+; 

(3)检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度;

(4)检查模板和引物的用量;

(5)增加循环次数和/或模板DNA的用量。


服务项目

收费标准

备注

SYBR Green染料法(mRNA)---单孔

80元/样本/基因

 

 

免费设计合成引物,本价格包含了所需 的试剂和耗材,需提供内参基因序列

SYBR Green 染料法(mRNA)---二复孔

120元/样本/基因

SYBR Green 染料法(mRNA)---三复孔

160元/样本/基因

SYBR Green 染料法(miRNA)---单孔

200元/样本/基因

SYBR Green 染料法(miRNA)---三复孔

360元/样本/基因

实时荧光定量PCR(Taqman探针法)---单孔

120元/样本/基因

本价格包含了所需的试剂和耗材;需提 供内参基因序列;不含探针价格

实时荧光定量PCR(Taqman探针法)---三复孔

260元/样本/基因

Taqman探针

2500元/条

合成探针费用

石蜡标本DNA提取

80元/样本



 注意事项:

1.样本要求:组织、细胞、血液、体液等;

2.DNA样本-20℃保存,RNA样本-80℃保存;干冰运输。




XML 地图