js99990金沙(澳门)有限公司Welcome

SYBR Green 染料法(mRNA)---三复孔

2017-05-11

amoxicillin uk

how to take amoxicillin motoblog.benndorf.de buy antibiotics online

amoxicillin side effect

amoxicillin 500mg capsules for humans joshnock.com buy amoxicillin for dogs

buy tamoxifen citrate uk

tamoxifen

buy female viagra

female viagra uk

buy female viagra

buy female viagra read female viagra for sale

clomid online

clomid online reviews kristinasmith.us clomid birmingham

prednisolone side effects

buy prednisolone 25mg tablets read here cheap prednisolone

clomid uk sale

buy clomid tablets

buy naltrexone online cheap

naltrexone buy online click naltrexone where to buy

naltrexone buy

naltrexone buy online canada blog.lppinsonneault.com how to buy naltrexone

amoxicillin rash

amoxil for uti blog.simplecode.eu amoxicillin allergy

where can i buy low dose naltrexone

buy naltrexone online canada

antibiotics online for stds

buy antibiotics for fish starksplastics.com buy antibiotics for chickens

where to buy abortion pill

buy abortion pill online redirect abortion pill over the counter

naltrexone for alcoholism

where to buy naltrexone in uk blog.zycon.com naltrexone for alcoholism

abortion pill ph

buy abortion pill read here abortion pill online philippines

abortion pill over the counter in usa

abortion pill online usa

buy abortion pill online usa

abortion pill online usa

实时荧光定量PCR(SYBR Green染料法,miRNA)

1. 原理

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团,使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系,从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型,符合2N方程(其中N为PCR的循环次数),但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别,之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量,并由此推断起始模板含量。

2. microRNA(miRNA)

小分子核糖核酸(microRNA)是进化守恒的、小的、非编码RNA分子,保守估计至少调控30%的总蛋白编码基因。目前有超过2900个 miRNA已经被注释,包括来自植物、蠕虫、苍蝇、哺乳动物和病毒等。目前的研究认为,miRNA与生物的发展、分化、细胞凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症息息相关。

miRNA大小一般在~ 22 nt左右,由于miRNA只代表一小部分的总RNA,检测它们是很困难的,利用传统的PCR方法根本无法分析。目前已经有很多商业化的试剂盒可以用于miRNA检测,其灵敏度高,操作方便。

3. 类型

实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。

4.  SYBR Green I检测  

 SYBR GreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料,它只有与dsDNA结合后才会发出荧光。在变性时,DNA双链分开,不产生荧光;在复性和延伸时,形成dsDNA,SYBR GreenI发出荧光。荧光强度逐渐增强,直到达到阈值,被荧光探测系统检测到。因此,荧光强度可以代表扩增产物的数量。

SYBR Green I的优点:

①成本较低,不需合成和标记探针;

②适合初步筛查:选用SYBR筛查,再用探针法精确定量少数关键样品。

SYBR Green I的缺点:

①特异性差,不能分辨主带与杂带,给出的是总信号,所以在低样本浓度时,不能进行基因突变分析。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体和非特异性产物区别开来,不需要通过电泳鉴定;

②不能做多重检测,每孔只能检测1个目标基因;③灵敏度低,适合于5000拷贝以上的基因定量。

5. 实验步骤

(1)样品RNA的提取

    取新鲜的组织或细胞(如果不能立即开展实验,应将样品置于-80℃冰箱保存),加入适量的Trizol裂解液,使组织或细胞中的内容物释放出来。采用有机溶剂氯仿/异丙醇抽提,提取组织或细胞中的总RNA。

(2)RNA浓度及纯度检测

    采用琼脂糖凝胶电泳定性检测提取的总RNA的浓度及纯度,并且使用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。

(3)cDNA第一条链的合成

按照说明书的要求在反应体系中加入500 ng的总RNA、miRNA RT prime、dNTP Mix、RNase Inhibitor 、RT Enzyme、miRNA RT Buffer,用无核酸酶ddH2O补足体积。保证每个样品加入的总RNA量相同。然后置于PCR仪中扩增合成cDNA第一条链。

(4)待测样品的管家基因及待测基因实时荧光定量PCR

实验开始时根据实验要求设计并合成内参基因和待测基因引物。按照说明书要求在反应体系中加入SYBR Green Mix、cDNA模版、内参基因或待测基因miRNA上下游引物,用ddH2O补足体积。然后置于荧光定量PCR仪中,设置好参数,进行扩增。

(5)数据处理

观察扩增曲线和溶解曲线,根据实验结果数据,计算样品Ct值。

6. PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:

(1)将PCR反应的试管与反应板紧贴;

(2)当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热; 

(3)不要随意减少dNTP的用量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡;

(4)对于有问题的PCR反应,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加Taq酶前的体系进行预变性,后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物:

(1)在提供MgCl2缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;

(2)泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgCl2,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+; 

(3)检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度;

(4)检查模板和引物的用量;

(5)增加循环次数和/或模板DNA的用量。




XML 地图